El grado de pureza de la proteína requerido depende del uso final previsto de la proteína.
Para algunas aplicaciones, un extracto crudo es suficiente. Sin embargo, para otros usos, como en alimentos y productos farmacéuticos, se requiere un alto nivel de pureza. Para lograr esto, se usan típicamente varios métodos de purificación de proteínas, en una serie de etapas de purificación.
Cada paso de purificación de proteínas generalmente da como resultado un cierto grado de pérdida de producto. Por lo tanto, una estrategia ideal de purificación de proteínas es aquella en la que se alcanza el mayor nivel de purificación en la menor cantidad de pasos. La selección de los pasos a usar depende del tamaño, la carga, la solubilidad y otras propiedades de la proteína diana. Las siguientes técnicas son las más apropiadas para purificar una sola proteína citosólica. La purificación de complejos de proteínas citosólicas es más complicada y generalmente requiere la aplicación de diferentes métodos.
Primeros pasos para la purificación de proteínas
El primer paso en la purificación de proteínas intracelulares (dentro de la célula) es la preparación de un extracto crudo .
El extracto contendrá una mezcla compleja de todas las proteínas del citoplasma celular y algunas macromoléculas, cofactores y nutrientes adicionales. El extracto crudo se puede usar para algunas aplicaciones en biotecnología, sin embargo, si la pureza es un problema, se deben seguir los pasos de purificación posteriores.
Los extractos de proteína bruta se preparan mediante la eliminación de restos celulares generados por la lisis celular, que se logra utilizando productos químicos y enzimas , sonicación o una prensa francesa. Los desechos se eliminan por centrifugación y el sobrenadante se recupera. Se pueden obtener preparaciones crudas de proteínas extracelulares simplemente eliminando las células por centrifugación.
Para ciertas aplicaciones de biotecnología , existe una demanda de enzimas termoestables : Enzimas que pueden tolerar altas temperaturas sin desnaturalizar, y al mismo tiempo mantener una actividad específica alta. Los organismos que los producen a veces se llaman extremófilos. Un enfoque fácil para purificar una proteína resistente al calor es desnaturalizar las otras proteínas en la mezcla calentando, luego enfriando la solución (permitiendo así que la enzima termoestable se reforme o redisuelva, si es necesario. Las proteínas desnaturalizadas pueden luego eliminarse por centrifugación.
Pasos de purificación intermedios
En el pasado, un segundo paso común para purificar una proteína de un extracto crudo era por precipitación en una solución con alta fuerza osmótica (es decir, soluciones salinas). Los ácidos nucleicos en el extracto crudo se pueden eliminar precipitando agregados formados con sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina.
La precipitación de proteínas generalmente se realiza usando sulfato de amonio como la sal.
Diferentes proteínas precipitarán en diferentes concentraciones de sulfato de amonio . En general, las proteínas de mayor peso molecular se precipitan en concentraciones más bajas de sulfato de amonio. La precipitación de sal no suele conducir a una proteína altamente purificada, pero puede ayudar a eliminar algunas proteínas no deseadas en una mezcla y concentrar la muestra. A continuación, las sales en la solución se eliminan por diálisis a través de un tubo de celulosa porosa, filtración o cromatografía de exclusión en gel.
Los modernos protocolos de biotecnología a menudo aprovechan los muchos kits disponibles comercialmente que ofrecen soluciones ya preparadas para procedimientos estándar. La purificación de proteínas a menudo se realiza usando filtros y columnas preparadas de filtración en gel. Todo lo que tiene que hacer es seguir las instrucciones y agregar el volumen correcto de la solución correcta y esperar el tiempo especificado mientras recolecta el eluyente (lo que sale por el otro extremo de la columna) en un tubo de ensayo nuevo.
- Los métodos cromatográficos se pueden aplicar utilizando columnas de mesa o equipos de HPLC automatizados. La separación por HPLC se puede realizar mediante métodos de fase inversa, intercambio de iones o exclusión por tamaño, y muestras detectadas mediante matriz de diodos o tecnología láser. 1.
Visualización de proteínas y evaluación de la purificación
- La cromatografía de fase inversa (RPC) separa las proteínas en función de sus hidrofobicidades relativas. Esta técnica es altamente selectiva pero requiere el uso de solventes orgánicos. Algunas proteínas se desnaturalizan permanentemente por solventes y pierden funcionalidad durante RPC. Por lo tanto, este método no se recomienda para todas las aplicaciones, particularmente si es necesario que la proteína objetivo retenga actividad.
- La cromatografía de intercambio iónico se refiere a la separación de proteínas en función de la carga . Las columnas pueden estar preparadas para el intercambio de aniones o el intercambio de cationes. Las columnas de intercambio aniónico contienen una fase estacionaria con una carga positiva que atrae proteínas con carga negativa. Las columnas de intercambio catiónico son las perlas cargadas negativamente, inversas, que atraen proteínas cargadas positivamente. La elución de la (s) proteína (s) diana se realiza cambiando el pH en la columna, lo que da como resultado un cambio o neutralización de los grupos funcionales cargados de cada proteína.
- La cromatografía de exclusión por tamaño ( filtración en gel ) separa las proteínas más grandes de las pequeñas ya que las moléculas más grandes viajan más rápido a través del polímero reticulado en la columna de cromatografía. Las proteínas grandes no encajan en los poros del polímero, mientras que las proteínas más pequeñas sí lo hacen, y tardan más en viajar a través de la columna de cromatografía, a través de su ruta menos directa. El eluato se recoge en una serie de tubos que separan las proteínas en función del tiempo de elución. La filtración en gel es una herramienta útil para concentrar una muestra de proteína ya que la proteína objetivo se recoge en un volumen de elución menor que el que se añadió inicialmente a la columna. Se pueden usar técnicas de filtración similares durante la producción de proteínas a gran escala debido a su costo-efectividad.
- La cromatografía de afinidad es una técnica muy útil para "pulir" o completar el proceso de purificación de proteínas. Las perlas en la columna de cromatografía están reticuladas a ligandos que se unen específicamente a la proteína diana. La proteína luego se elimina de la columna enjuagando con una solución que contiene ligandos libres. Este método proporciona los resultados más puros y la actividad específica más alta en comparación con otras técnicas.
- SDS-PAGE es electroforesis en gel de poliacrilamida, realizada en presencia de SDS (dodecilsulfato de sodio) que se une a las proteínas dándoles una gran carga neta negativa. Como las cargas de todas las proteínas son bastante iguales, este método las separa casi por completo en función del tamaño. SDS-PAGE se usa a menudo para probar la pureza de la proteína después de cada paso en una serie. A medida que las proteínas indeseadas se eliminan gradualmente de la mezcla, se reduce el número de bandas visualizadas en el gel de SDS-PAGE, hasta que solo hay una banda que representa la proteína deseada.
- La inmunotransferencia es una técnica de visualización de proteínas aplicada en combinación con cromatografía de afinidad. Los anticuerpos para una proteína específica se usan como ligandos en una columna de cromatografía de afinidad. La proteína objetivo se retiene en la columna y luego se elimina enjuagando la columna con una solución salina u otros agentes. Los anticuerpos ligados a marcadores radiactivos o colorantes ayudan a la detección de la proteína diana una vez que se separa del resto de la mezcla.
Fuentes:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., Nueva York, NY, EE. UU.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edición AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Nueva Jersey, EE. UU. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.