Medición de la cinética enzimática
Como un poco de antecedentes, las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores en la reducción de la cantidad de energía de activación para que se produzca una reacción. La energía de activación es la energía que se requiere para que las reacciones comiencen, ya que muchas reacciones no ocurren muy rápidamente (o ocurren en absoluto) si son termodinámicamente posibles.
Las enzimas catalizan reacciones específicas en un sitio particular (conocido como el sitio activo) donde los reactivos se unen y reaccionan para generar los productos. Los sustratos tienen sitios activos que son específicos solo para ellos, de modo que ninguna otra sustancia se une o reacciona en el mismo sitio. Como un candado y una llave, cada enzima catalizará solo una reacción específica (con algunas excepciones).
La actividad específica se usa en los métodos de aislamiento de proteínas para indicar el porcentaje de purificación. Es importante conocer esta unidad al comprar enzimas para indicar exactamente la cantidad de enzima pura que está obteniendo.
Cuando se mide la cinética enzimática (la velocidad de reacción de una enzima con un sustrato o superficie), la actividad específica se define como la cantidad de sustrato que la enzima convierte (reacciones catalizadas), por mg de proteína en la preparación enzimática, por unidad de tiempo.
Un ejemplo de actividad específica sería:
- La actividad específica de la enzima aislada se midió a 150 umoles / min / mg de proteína antes de la purificación y 800 umoles / min / mg, después de la purificación.
La actividad específica es una medida importante de la pureza de la enzima. Los diferentes lotes de una enzima pura deben tener los mismos valores e incluso diluir una solución enzimática muchas veces tendrá valores de actividad específicos idénticos aunque existan diferentes valores de actividad enzimática. Esto se debe a que al calcular la actividad específica, el numerador (unidades / ml) y el denominador (mg / ml) se ven afectados por igual.
La actividad específica es muy diferente de la actividad, pero el cálculo de la actividad específica aún depende del valor de la actividad. Esto significa que el valor de actividad específico indicado también dependerá de la definición de la unidad de enzima.
Los lotes de enzimas que tienen un valor de actividad específico inferior al esperado pueden contener moléculas de enzima que se han alterado o mezclado con impurezas.
Factores que afectan la actividad de la enzima
Es posible que una enzima tenga diferentes valores de actividad medidos cuando se miden en diferentes laboratorios (es decir, diferencias reales en la actividad medida, diferencias no aparentes causadas por el uso de diferentes definiciones de unidades).
La forma en que se realiza un ensayo (el método de prueba para determinar la pureza de las enzimas) influirá en los valores de actividad informados. Por ejemplo, las enzimas generalmente son más activas entre temperaturas de 37 grados Celsius en comparación con a 20 grados Celsius, por lo que si un ensayo se lleva a cabo a 21 grados Celsius, los valores diferirán de los ensayos realizados a una temperatura de 32 grados Celsius (típicamente , los ensayos se llevan a cabo a una temperatura entre 20-37 grados Celsius).
Por lo tanto, la definición de la unidad de enzima se expresaría mejor como 1 unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la reacción de 1 nmol de sustrato por minuto en condiciones estándar.