La clonación de genes es el acto de hacer copias o clones de un solo gen. Una vez que se identifica un gen, los clones se pueden usar en muchas áreas de la investigación biomédica e industrial. La ingeniería genética es el proceso de clonar genes en nuevos organismos o alterar la secuencia de ADN para cambiar el producto proteico. La ingeniería genética depende de nuestra capacidad para realizar los siguientes procedimientos esenciales.
01 Reacción en cadena de la polimerasa
02 Enzimas de restricción
El descubrimiento de enzimas conocidas como endonucleasas de restricción ha sido esencial para la ingeniería de proteínas . Estas enzimas cortan el ADN en ubicaciones específicas basadas en la secuencia de nucleótidos. Cientos de diferentes enzimas de restricción , capaces de cortar ADN en un sitio distinto, se han aislado de muchas cepas diferentes de bacterias. El ADN cortado con una enzima de restricción produce muchos fragmentos más pequeños, de diferentes tamaños. Estos se pueden separar usando electroforesis en gel o cromatografía.
03 Electroforesis
Purificar ADN de un cultivo celular o cortarlo usando enzimas de restricción no sería de mucha utilidad si no pudiéramos visualizar el ADN, es decir, encontrar una forma de ver si el extracto contiene algo o qué tamaño te fragmenta. lo he cortado. Una forma de hacerlo es mediante electroforesis en gel. Los geles se usan para una variedad de propósitos, desde visualizar el ADN cortado hasta detectar insertos de ADN y nocauts.
04 Únete a dos piezas de ADN
En la investigación genética, a menudo es necesario vincular dos o más cadenas individuales de ADN para crear una cadena recombinante o cerrar una cadena circular que se ha cortado con enzimas de restricción. Las enzimas llamadas ADN ligasas pueden crear enlaces covalentes entre las cadenas de nucleótidos. Las enzimas ADN polimerasa I y polinucleótido quinasa también son importantes en este proceso, para rellenar huecos o fosforilar los extremos 5 ', respectivamente.
05 Selección de ADN pequeño autorreplicante
Pequeñas piezas circulares de ADN que no son parte de un genoma bacteriano, pero que son capaces de autorreplicarse, se conocen como plásmidos. Los plásmidos se usan a menudo como vectores para transportar genes entre microorganismos. En biotecnología, una vez que el gen de interés ha sido amplificado y tanto el gen como el plásmido son cortados por enzimas de restricción, se ligan generando lo que se conoce como ADN recombinante. El ADN viral (bacteriófago) también se puede usar como un vector, al igual que los cósmidos, plásmidos recombinantes que contienen genes de bacteriófagos.
06 Método para mover un vector a una célula anfitriona
El proceso de transferencia de material genético en un vector, como un plásmido, a nuevas células hospedadoras, se llama transformación. Esta técnica requiere que las células anfitrionas estén expuestas a un cambio ambiental que las hace "competentes" o temporalmente permeables al vector. La electroporación es una de esas técnicas. Cuanto más grande es el plásmido, menor es la eficiencia con la que es absorbido por las células. Los segmentos de ADN más grandes se clonan más fácilmente usando bacteriófagos, retrovirus u otros vectores virales o cósmidos en un método llamado transducción. Los vectores fagos o virales a menudo se usan en medicina regenerativa, pero pueden causar la inserción de ADN en partes de nuestros cromosomas donde no lo queremos, causando complicaciones e incluso cáncer.
07 Métodos para seleccionar organismos transgénicos
No todas las células tomarán ADN durante la transformación. Es esencial que haya un método para detectar los que sí lo hacen. En general, los plásmidos portan genes para la resistencia a los antibióticos y las células transgénicas se pueden seleccionar basándose en la expresión de esos genes y su capacidad para crecer en los medios que contienen ese antibiótico. Los métodos alternativos de selección dependen de la presencia de otras proteínas informadoras tales como el sistema x-gal / lacZ o la proteína de fluorescencia verde, que permiten la selección basada en el color y la fluorescencia, respectivamente.