Los ajustes a cualquiera de los componentes de una reacción de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden alterar la calidad del resultado, mejorando o disminuyendo el rendimiento y la calidad del producto o mejorando la sensibilidad y la especificidad de la reacción. Los parámetros que influyen en el resultado final pueden ser físicos (es decir, temperatura, tiempos de ciclo) o químicos (es decir, concentración de plantilla, tipo de enzima utilizada). Los siguientes son varios factores clave que influyen en el éxito de la PCR.
01 Limpiar las condiciones del laboratorio
Dado que la PCR es capaz de detectar una sola molécula de ADN, es importante mantener las condiciones prístinas en el laboratorio. Use siempre guantes nuevos, use material de vidrio estéril, tubos y puntas de pipeta y soluciones estériles, y limpie el área de trabajo antes de comenzar a trabajar.
Siempre incluya reacciones de control, sin ADN molde y sin enzima, para garantizar que los resultados se deben verdaderamente a la amplificación de la muestra correcta.
La mayoría de las personas se aseguran de tener su propio conjunto de soluciones que no se comparten para facilitar la solución de problemas y las pipetas designadas a menudo se reservan solo para PCR. Los tubos PCR sin DNasa y RNasa, las puntas de pipeta resistentes a aerosoles y el trabajo en una campana extractora con luz UV también son formas de minimizar los problemas.
02 Componentes químicos
- Tener 18 a 24 bases
- No tienen estructura secundaria (es decir, bucles en horquilla)
- Tener distribución balanceada de G / C y pares A / T
- No son complementarios entre sí en los extremos de 3 pies
- Tener temperaturas de fusión (Tm) de 5-10 grados Celsius por debajo de la temperatura de recocido, que generalmente es entre 55 y 65 grados Celsius.
La Tm para ambos cebadores también debería ser similar para obtener mejores resultados.
03 Mezcla de reacción: plantilla y cebadores
Las concentraciones óptimas de cebador están entre 0.1 y 0.6 micromoles / L. La cantidad de plantilla varía según el tipo de ADN (humano, bacteriano, plásmido).
Con cantidades muy bajas de plantillas, existen otras estrategias para mejorar los resultados, como un mayor número de ciclos o el uso de "inicio en caliente". Siempre pruebe nuevas imprimaciones con una reacción de control positivo, para asegurarse de que funcionen bajo sus condiciones experimentales específicas.
04 mezcla de reacción: actividad enzimática
La concentración de MgCl2 en la mezcla de reacción puede influir en el resultado de la PCR y podría jugar un papel importante en reacciones más exigentes. El catión magnesio forma complejos solubles con dNTP para producir el sustrato real que la enzima polimerasa reconoce.
Cantidades iguales de los cuatro dNTP también ayudan a reducir la tasa de error de la polimerasa. Ciertos aditivos como betaína, BSA, detergentes, DMSO, glicerol y pirofosfatasa también pueden afectar la especificidad de la enzima o la eficiencia de la reacción.
05 Tipo de termociclador
Al comprar equipos de laboratorio, tenga en cuenta que algunos termocicladores son menos precisos que otros para mantener las temperaturas exactas y deseadas.
Esta es un área donde ir barato no valdrá la pena a la larga cuando se enfrenta a una reacción meticuloso o el uso de imprimadores que requieren un estrecho rango de temperatura de recocido.
Los tubos de reacción de pared delgada diseñados para ajustarse a la marca precisa de termociclador que está utilizando, también ayudan a optimizar las temperaturas de reacción.
06 Configuraciones de ciclo
Se puede lograr un mayor rendimiento aumentando el tiempo de extensión aproximadamente cada 20 ciclos, para compensar la reducción de la cantidad de enzimas en la plantilla. Usualmente, menos de 40 ciclos son suficientes para amplificar menos de 10 moléculas molde a una concentración lo suficientemente grande como para verse en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.